Дегенерация межпозвоночного диска ассоциирована с утратой фенотипа клеток пульпозного ядра и деградацией внеклеточного матрикса — оба процесса связаны с изменениями сократимости цитоскелета и формы клеток. В данном исследовании учёные проверили гипотезу о том, может ли микросреда-специфическая модуляция сигнального пути RhoA восстановить морфологию и экспрессию генов, характерную для пульпозного ядра, в клетках, культивируемых в 2D- и 3D-условиях.
В 2D-монослойной культуре, где клетки распределены и механически активированы, фармакологическое ингибирование RhoA с помощью CT04 снижало активность RhoA, уменьшало экспрессию генов актомиозиновой сократимости и сдвигало морфологию в сторону меньшего, более округлого фенотипа. Массовое РНК-секвенирование показало, что обработка CT04 повышала экспрессию генов фенотипа пульпозного ядра и генов, связанных с матриксом, включая ACAN (аггрекан), GDF5 (фактор роста и дифференцировки 5), CHST3 (хондроитинсульфотрансфераза 3) и MUSTN1, при одновременном снижении экспрессии катаболических генов и генов, ассоциированных с фибробластами, включая ADAMTS1/9 и COL1 (коллаген I типа), что согласуется с обогащением путей внеклеточного матрикса.
Напротив, активация RhoA с помощью CN03 в 2D-культуре повышала интенсивность актина и фосфорилированной лёгкой цепи миозина, но давала ограниченное улучшение фенотипа. В 3D-альгинате, который минимизирует интегрин-опосредованную адгезию, базальные маркёры актомиозина были снижены по сравнению с 2D-культурой. В альгинате активация RhoA с помощью CN03 увеличивала количество актина, фосфорилированной лёгкой цепи миозина и экспрессию генов актомиозина, однако также способствовала более компактной, округлой морфологии и повышению маркёров пульпозного ядра, включая ACAN и KRT19 (кератин 19), при повторном введении препарата.
Во всех культурных условиях повышенная округлость клеток последовательно ассоциировалась с повышенной экспрессией ACAN, что указывает на сильную связь между состоянием цитоскелета, морфологией и программами матрикса пульпозного ядра. Совокупность полученных данных демонстрирует, что возмущение сигнального пути RhoA может способствовать экспрессии генов фенотипа пульпозного ядра как в 2D-, так и в 3D-культуре, но направление оптимальной модуляции зависит от микросреды, что поддерживает рассмотрение сигнального пути RhoA как зависимой от контекста терапевтической мишени для регенерации дисков.
Данное исследование имеет важное клиническое значение для разработки подходов к лечению дегенеративных заболеваний позвоночника. Межпозвоночная дисковая дегенерация является одной из ведущих причин хронической боли в спине и инвалидности во всём мире. Традиционные подходы к лечению в основном направлены на симптоматическое облегчение, в то время как восстановление структурной целостности диска остаётся нерешённой задачей. Открытие контекстно-зависимой роли сигнального пути RhoA открывает новые возможности для разработки целенаправленных терапевтических стратегий, которые могли бы адаптироваться к конкретным условиям микросреды повреждённого диска.
Методологически исследование демонстрирует важность учёта механических и архитектурных особенностей клеточной микросреды при разработке регенеративных подходов. Контраст между эффектами ингибирования RhoA в 2D-культуре и активации в 3D-альгинате подчёркивает сложность биомеханической регуляции клеточного фенотипа и необходимость тщательного подбора терапевтических интервенций в зависимости от конкретной патологической ситуации.